珠海灵敏度qPCR仪使用说明

染料法是指在qPCR反应体系中加入一种与双链DNA分子结合的荧光染料，包括SYBR®Green I、BEBO和LC Green TMI等染料，它们可以与双链DNA（double strands DNA，dsDNA）的小沟非特异性结合，激发较强的荧光产生。经荧光定量PCR仪器检测后，对核酸进行定性和定量分析。qPCR 染料法原理:这种方法的优点是，需要一对特异性引物，操作简单、检测成本低。缺点是由于荧光染料非特异结合dsDNA产物，无法正确区分目的产物，尤其是染料结合引物二聚体易产生错误的扩增曲线，易形成误判。虽然在PCR扩增程序后添加熔解曲线分析，可以方便判断生成的荧光扩增曲线是否属于目的产物，但是对于高灵敏度要求的实验来说，染料法并不是比较好的选择。SYBR Green I 是一种结合于所有双链DNA（dsDNA）双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。珠海灵敏度qPCR仪使用说明

实时荧光定量PCR（QPCR）：一般用于检测样品中目的基因的表达量。比如：在实验过程中，构建了目的基因的过表达载体，转染进细胞后，实验中需要在转录水平和蛋白水平检测目的基因的表达，转录水平就需要用到QPCR，蛋白水平就是WB。也可用于检测基因组DNA中目的基因的拷贝数。主要步骤：从细胞/血液/组织中提取RNA，检测RNA纯度-去除基因组DNA-逆转录成cDNA-配置QPCR预混液-QPCR96孔板排版加样，3个复孔-上机QPCR仪器检测-据CT值分析实验结果。根据荧光类型主要分为荧光嵌合法（又称为染料法）和荧光探针法。 珠海灵敏度qPCR仪使用说明dPCR比qPCR准确度与精密度高。

PCR方法:PCR的原理在这里不需要进一步解释。多年来，研究人员基于此开发了一系列衍生技术。当前的PCR方法可分为三类：终点PCR，qPCR和dPCR。终点PCR:端点PCR是原始，简单的PCR方法，并且仍然被使用。PCR反应完成后，用户只能通过凝胶电泳，毛细管电泳等方法检测产物。终点PCR本身无法量化，因为反应产生的DNA数量可能无法反映初始情况。例如，不同样品和序列之间的扩增效率存在差异。DPCR通常更准确。 qPCR可以轻松区分两倍的浓度差异(例如5个拷贝和10个拷贝)，但是面对小的差异，它却较弱。 dPCR理论上可以识别相差少于20%的拷贝数，例如5和6拷贝。该准确度对于量化涉及染色体重排的基因的拷贝数或量化患者血液中的循环生物学指标特别有用。由于dPCR相当于在反应结束时稀释样品并读取数据，因此dPCR比qPCR对抑制剂的抵抗力更高。

qPCR中的荧光探针是一种短链寡核苷酸，带有荧光基团和淬灭基团，它可以特异结合目的产物的DNA序列。其检测原理是荧光共振能量转移（FRET），即荧光基团和淬灭基团在目标DNA分子扩增过程中因为聚合酶的外切活性从而水解分离使荧光信号的释放；随着扩增过程的推进，机器实时检测增强的荧光信号，从而产生终的荧光扩增曲线。根据修饰基团标记和能量转移方式，可以将探针分为TaqMan探针、分子信标和其他探针。TaqMan探针（荧光淬灭水解探针）现今常用的TaqMan探针主要是水解探针，其多是5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团的短单链寡聚核苷酸。在qPCR反应中，基于TaqDNA聚合酶的5’-3’核酸外切酶活性，对TaqMan探针进行切割，使荧光基团和猝灭基团分离，荧光基团发出的荧光信号不会被淬灭，释放的荧光信号被机器接收。TaqMan探针的qPCR相比于染料法多了一条TaqMan探针，可以特异性结合DNA序列，因而具有更好的特异性，但探针合成价格偏高。q225 出色的热循环系统设计使得40 个循环的常规 qPCR 可以在短短43 分钟内轻松完成，让您的工作效率获得质提升 。

传统定量PCR方法简介：1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。qPCR通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。广东酷博qPCR仪仪器

qPCR 反应所需时间取决于反应溶液进行变温所需要的时间，这过程受到加热块升降温速度和液体升降温速度影响。珠海灵敏度qPCR仪使用说明

qpcr的检测原理：qPCR主要是使用插入染料或荧光探针(例如TaqMan)，利用实时积累的荧光信号监测整个扩增过程，然后通过标准曲线来对未知模板进行定量分析。qPCR 主要是依赖于标准品制备标准曲线，进而去确定未知样品的浓度，因此是一种相对定量的方法。随着PCR的循环进行，染料荧光强度增加，从而检测到定量反应的DNA。SYBR Green是一种DNA插入染料，范围广用于qPCR。虽然SYBR Green方法比探针方法便宜，但是特异性没有荧光探针方法好。珠海灵敏度qPCR仪使用说明

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